豬場檢疫非洲豬瘟PCR熒光定量樣品采集的嚴格要求
一個完整的非洲豬瘟病原熒光定量PCR檢測流程一般包括：樣品采集及保存；樣品前處理；核酸提取與配液；上機擴增；檢測結果導出及分析等。
從實驗流程來看
樣本的正確采集及運輸是保證實驗室檢測結果的首要因素。
采集什么樣品？多少數(shù)量合適？怎么規(guī)范采集？采集后該怎么處理？如果不進行及時檢測，又該怎么保存樣品？檢測完的樣本又該怎么處理？
以檢測非洲豬瘟病毒為例，參考FAO《非洲豬瘟-發(fā)現(xiàn)與診斷》中文版如進行非洲豬瘟病毒檢測，病原學樣品包括：
1. 抗凝血（全血）：
采集：使用含有抗凝劑（EDTA-紫色蓋）的無菌管（真空采血管）從頸靜脈、下腔靜脈或耳緣靜脈抽取全血5ml。如果動物已經(jīng)死亡，可以從心臟中采血，但必須立即進行。冷藏運輸，到達檢測實驗室后，可選擇-70℃冷凍保存。
注意：不能使用肝素（綠色蓋子）的無菌采血管，會抑制PCR反應，易造成假陰性。
2. 血清：
采集：使用未加抗凝劑的真空采血管從頸靜脈、下腔靜脈、耳緣靜脈，或剖檢過程收集5ml血液樣品，建議先在4℃放置14-18小時分離血凝塊，丟棄凝固物，并離心10-15分鐘，回收澄清的上清液（血清），血清樣品在分離后可以立即開展檢測，也可冷藏運輸，到達實驗室后，可選擇-70℃冷凍保存。
注意：如血清是紅色，已經(jīng)發(fā)生溶血，不能用于ELISA檢測。
3. 器官和組織樣品
采集：目標器官是脾臟、淋巴結、扁桃體、腎臟等，其中脾臟和淋巴結通常病毒含量最高，冷藏運輸，盡快提交給實驗室，如無法及時送檢，可將樣品儲存在冷庫或液氮中。可用10%緩沖福爾馬林浸泡30分鐘以上進行病毒的滅活之后再進行PCR的檢測。
注意：如豬場發(fā)現(xiàn)疑似非洲豬瘟癥狀，為避免污染場內環(huán)境和人員，請勿在豬場內剖檢，盡量求助實驗室，根據(jù)相關實驗數(shù)據(jù)表明，病死豬每克組織中含PLD50病毒含量達10萬以上。
4. 軟蜱
采集：收集軟蜱，盡量讓蜱存活以確保蜱內病毒的保存完好，并避免DNA降解。可將收集的鈍緣軟蜱放入有螺旋蓋的樣品瓶/管中，放入少量土壤，蓋內襯以紗布，常溫保存運輸。到達檢測實驗室后，-70℃ 冷凍保存或置于液氮中；如僅對樣品進行形態(tài)學觀察，可以放入100%酒精中保存。
注意：其余如蚊蠅等昆蟲同樣如此，盡量使其存活送檢，或者直接儲存在液氮中。
5. 環(huán)境樣品
采集：可多采集環(huán)境拭子，如糞便，泔水，飼料等，4℃保存。
6、唾液樣品
除上訴非洲豬瘟疫情應急實施方案（2019年版）中提到的相關病原學樣品外，根據(jù)非洲豬瘟的同居感染實驗結果顯示，非洲豬瘟自然感染情況下病毒最早出現(xiàn)在唾液中，因此建議在無癥狀豬群定期排查時使用唾液作為檢測對象。
采集：采集唾液前盡量對豬群實行停料不停水，可選擇控食過夜，在第二天進食前采集唾液，保證唾液里面沒有食物殘渣，確保唾液樣本質量不會影響檢測結果，同時采集到的唾液如果1小時內不能做核酸提取就需要馬上冷凍。
為了獲得正確的診斷，必須在適當?shù)臏囟认?，以最快的速度正確采集樣品，仔細進行包裝保存、做好標記，盡快到達檢測實驗室，運輸?shù)臉悠繁仨氂凶銐驍?shù)量的冷卻材料，例如冰袋，以防止變質。
實驗室工作是特別需要樣本支撐的！如果樣品狀況不佳，后續(xù)工作可以不用開展，因為無法做出準確的診斷。
筆者言：對于高效、科研機構、動檢動監(jiān)、屠宰企業(yè)、集團化企業(yè)，有專業(yè)的實驗室、專業(yè)的人員、專業(yè)的素質用PCR做檢測是最科學準確的。PCR設備并不適合現(xiàn)場使用，主要是環(huán)境中可能會存在的污染，非常容易導致“假陽性”，給診斷帶來不必要的誤導。
對于家庭農場和中小豬場而言，針對正在發(fā)病的豬和剛剛死亡的豬，使用非洲豬瘟抗原免疫層析快件卡是一個合適的選擇，病毒載量大診斷率更高更合理。
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